Boyalar ve Bakteri Boyama Metodları

BOYALAR VE BAKTERİ BOYAMA METODLARI

Mikroorganizmaların morfolojik ve biyolojik özellikleri ancak uygun bir şekilde hazırlanmış ve boyanmış preperatların mikroskobik incelemesi ile belirlenebilir. Boyalar bakteri protoplazması ile kimyasal olarak birleşik yapan renkli organik bileşimleridir.
Mikrobiyolojide kullanılan boyalar kimyasal davranışları ve verdikleri reaksiyonlar bakımından üç gurpta incelenebilir.
1. Bazık Boyalar : Bu boyaların renkli kısımları katyon, renksiz kısımları ise anyonlarıdır. ( örneğin, metilen mavisi klarür...... gibi). Bu boyaların çözeltileri alkolde hazırlanır, suda çözünmezler. Tionin, metilen mavisi, bazık fuksin, hematoksil safranin, kristal viole, v.s. gibi boyalar bazık boyaların en çok kullanılanlarıdır.
Bazık boyaların pozitif yükleri ( renkli kısımları) ile, bakteri hücresindeki nukleik asitlerin fosfat gruplarındaki negatif yükler birleşerek çekirdek materyalının boyanmasını sağlarlar.
2. Asit Boyalar : Asidik boyalarının renkli kısımları anyon, renksiz kısımları katyonlarıdır. ( Örneğin, Sodyum , cosinat .......gibi ). Asidik boyalar hücre zarını ve stoplazmasını boyarlar, suda çözünürler. Önemlileri pikrik asit, nikrosin, asit fuksin ve fioksindir.
3. Nötr Boyalar : Asit ve baz boyaların bileşimi şeklinde olan boyalardır. Suda çözünürler. En çok kullanılanları Gimensa, wright ve Leishman boyalarıdır.

BOYAMA METOTLARI

Genel olarak boyama işlemi üç kademede gerçekleştirilir.
1. Preparatın hazırlanması : incelenecek olan maddeden katı veya sıva besiyelerinden alınan örnek temiz ve kuru alan üzerine iyice yayılır. Yayma için özel lam veya lamel kullanılır. Sonra lam havada kurutulur.
2. Fiksasyon : Fiksasyonun amacı lam üzerinde kurumuş olan mikroorganizmaların morolojik özellikleri bozulmadan canlılık faaliyetlerine son verilmiş ve lam yüzeyine yapışmalarının sağlanmasıdır. Dolayısı ile boyama işlemi esnasında lam üzerinde bulunan mikroorganizmaların akıp gitmeleri önlenmiş olur. Fiksasyon başlıca iki şekilde yapılır.
a) Fiziksel Fiksasyon : Lamın meteryal sürülü olan yüzü üstte kalacak şekilde kez bek alevinden geçirilmesi ile yapılan fiksasyondur.
b) Kimyasal fiksasyon : Daha çok kan ve Protozoon prepatları metil alkol (3 dakika) saf alkol ( 10 – 15 dakika ) ve alkel + eter ( 10 – 15 dakika ) ile fikse edilirler.
3. Boyama işlemi : Havada kurutularak fikse edilen preparat daha sonra çeşitli boyalarla muamele edilir. Buna göre iki tip boyama vardır.
A) Basit boyama B) Diferansiyel boyama
Bu iki tip boyamada ayrılan en önemli iki nokta basit boyamada sadece bir adet boyanın diferansiyel boyamada ise birden fazla boyanın kullanılmasıdır
A- Basit boyama : Basit boyama kısa sürede fikir vermesi bakımından önemli olmakla birlikte mikroorganizmaların teşhisi için yeterli olamamaktadır. Preparatı hazırlanarak tespit edilen bakteri kullanılan boyanın özelliğine göre ( örneğin metilen mavisi ile 1 dakika ) boyanır. Boya dökülerek preparat su ile yıkanır ve kurutma kağıdı ile kurutulur. Mikroskopta immersiyon objektifi ile incelenir. Metilen mavisi ile bakteriler mavi renkli görülürler.
B – Diferansiyel boyama ( Ayırıcı Boyama ) : Bu tip boyamada birden fazla boya kullanımı ve bakterilerin birbirinden ayrılmaları için uygulanır. Bileşik boyamaya en iyi örnek gram boyamasıdır. 1884 yılında Danimarkalı H.C. gram tarafından geliştirilen bu fuksini bırakarak ikinci boya olan metilen mavisi ile boyanırlar.
Giemsa Boyama : Daha çok kan ve doku prepatlarında bakteri riketsiya inklüzyon cisimleri( virüs kolonileri) sıtma parazitleri ve protozconların boyanmasında kullanılan bir tekniktir. Giemsa solusyonu stok solosyondan 1 / 10 oranında sulandırılarak kullanılacağı zaman hazırlanır. Giemsa boyamada kan prepatı, ince yayma ve kalın damla olmak üzere iki şekilde hazırlanır.
a) İnce kan yayma preparatının boyanması : Parmaktan alınan kan temiz bir lamın kenarına değdirilir. İkinci bir lam yardımı ile kan lam boyunca yayılır. Kurutularak metil alkol ile 5 dakika tespit edilir. Giemsa boyası ile 15 – 20 dakika boyama yapılır, su ile yıkanarak havada kurutulur. İmmersiyon objektif ile alyuvarların içindeki sıtma parazitleri mor – menekşe renkte görülürler.
b) Kalın damla praparatı: Temiz bir lamın ortasına bir damla kan konularak ikinci bir lamın köşesiyle 1 – 1,5 cm çapında yayılır. Pıhtılaşma olmayacak şekilde karıştırma işlemine birkaç dakika devam edilir. Kurutulduktan sonra makil alkolle tespit edilmeden 15 – 20 dakika boyama yapılır. Bu yaymada kan hücreleri 15 – 20 kat olacak şekilde yığılmışlardır. Hücreler tespit edilmediklerinden boyama esnasında parçalanırlar ve içerlerinde bulunan parazitler ortama yayılmış olarak görülürler.

Boyalar ve Çözeltiler :
1- Loeffler’in Mtilen Mavisi Boyası:
Metilen mavisi 0.3 gr, etenol (%95’lik ) 30 ml, distile su 100 ml. Boya etonelde çözünür, distile su ilave edilerek iyice karıştırılır ve filtre kağıdından sürülür.
2- Gram’ın kristal viole boyası :
Kristal viole 2 gr, etenol (%95’lik ) 20 ml, amonyum okzalat 0.8 gr, distile su 80 ml, 20 ml suda da amonyum akzalat çözülür ve iki çözelti iyice karıştırılır.
3- Gram’ın iyodür ( Lügol) çözeltisi :
İyot 1 gr, KI 2 gr , distile su 300 ml, iyot ve KI iyice karıştırılarak bir havanda toz haline getirilir. Üzerine yavaş yavaş su ilave edilerek iyice karıştırılır, süzülerek kullanılır.
4 – Karbon Fuksin Boyası:
Fuksin 10 gr, etenol ( %95’lik ) 9 ml, 5 ml fenik, 90 ml distile su. Önce toz boya alkolde çözülerek ana çözelti hazırlanır. Süzüldükten sonra 10 ml ana çözelti 5 ml asit fenik ve 90 ml distile su ile karıştırılır.
5 – Gram safranın boyası:
Safranın 0.25 gr, etenol ( % 95’lik ) 10 ml, distile su 100 ml safranın etenolde çözülür, su ilave edilerek iyice karıştırılır ve süzülür.
6 – Ziehl – Neslon’un Karbon Fuksin Boyası:
Bazik fuksin 0.3 gr, etenol ( %95’lik ) 10ml. Finol kristali 5 gr, distile su 95 ml. Bazik etenolde çözülür, başka bir kapta distile suda çözülen fenollü su ile karıştırılır.

[AyTeK54]

paylaşım için teşekkürler